设计反向引物、查看负链编码区或整理测序结果时，经常要生成反向互补序列。真正容易出错的地方不在碱基替换，而在5′、3′方向判断。弄清MacVector反向互补序列怎么生成MacVector反向互补后方向判断错误怎么办，先要分清“互补”“反向”和“反向互补”这三个概念。

　　一、MacVector反向互补序列怎么生成

　　反向互补包含两步：先把碱基换成互补碱基，再把排列顺序翻转。用于引物合成或序列比对时，结果通常仍按5′到3′方向记录。

　　1、对完整DNA序列执行反向互补

　　在单序列编辑窗口中，需要先选中完整序列，再执行反向互补操作。

　　①打开目标DNA序列文件。

　　②切换到【Editor】页面。

　　③进入【Edit】→【Select All】。

　　④继续执行【Edit】→【Reverse&Complement】。

　　⑤检查序列内容和长度是否变化正确。

　　MacVector的操作教程给出的完整序列翻转方式，就是先全选序列，再使用【Reverse&Complement】。如果当前使用的是Contig Editor，则可以直接执行该命令。

　　这项操作会改变当前编辑对象。原序列还要继续使用的话，建议提前另存一份，省得后面再翻回来。

　　2、手动核对反向互补结果

　　序列较短时，可以用一个简单例子检查方向：

　　原序列：5′-ATGCCGTA-3′

　　互补链：3′-TACGGCAT-5′

　　反向互补：5′-TACGGCAT-3′

　　这里最容易看错的是第二行。它虽然已经完成碱基互补，但方向仍然是3′到5′，不能直接作为常规引物序列提交。

　　3、处理负链编码区

　　在【Map】页面中，如果开放阅读框或CDS箭头指向相反方向，通常说明它位于互补链。MacVector支持直接识别负链ORF，也可以把整条序列反向互补后，再按正向方式查看。

　　①打开序列的【Map】页面。

　　②找到方向相反的CDS或ORF箭头。

　　③切换到【Editor】检查对应序列区域。

　　④需要整体翻转时，先保存原文件。

　　⑤完成反向互补后重新查看翻译方向。

　　只是查看蛋白翻译时，不一定非要翻转整条序列。MacVector可以识别负链选择区域，并按相应方向执行翻译。

　　4、生成反向引物序列

　　反向引物应写成其自身5′到3′方向，它对应目标正链结合区域的反向互补序列。

　　①选中目标序列中的反向引物结合区域。

　　②复制该区域的正链序列。

　　③执行反向互补转换。

　　④确认输出结果按5′到3′记录。

　　⑤再检查长度、GC含量和退火位置。

　　MacVector的引物工具提供反向互补功能，可用于把从正链复制的右侧引物区域翻转为实际需要合成的反向引物。Primer3结果中的右侧引物，则通常已经是可直接使用的5′到3′序列，不要再翻一次。

　　二、MacVector反向互补后方向判断错误怎么办

　　方向判断错误常见于两种情况：把互补链当成反向互补序列，或者对已经翻转过的反向引物再次操作。先看序列来源，再决定要不要重新转换。

　　1、检查5′和3′标记

　　①找到原始序列的方向标记。

　　②确认复制内容来自正链还是互补链。

　　③检查输出是否按5′到3′排列。

　　④不确定时，用短序列手动核对前后碱基。

　　如果原序列左端的前几个碱基，正好变成结果右端的互补碱基，通常说明反向互补方向是对的。

　　例如原序列5′端为ATG，反向互补结果的3′端应为CAT。只做了互补却没有反向时，这组碱基会出现在错误的一端。

　　2、避免对反向引物重复翻转

　　Primer3或其他引物设计工具输出的Reverse Primer，一般已经按照合成方向显示。

　　①查看序列来自原始模板还是引物结果表。

　　②确认是否标注为Right Primer或Reverse Primer。

　　③已是5′到3′引物序列时直接使用。

　　④只有复制模板结合区时才执行反向互补。

　　同一段序列翻转两次，会回到原来的正链内容。这个问题挺常见，尤其是从结果表复制后又习惯性点了一次转换。

　　3、检查上下链显示方式

　　MacVector可以在序列编辑界面显示互补链，并通过颜色区分正链和互补链。显示负链翻译时，也会按照相应方向排列。

　　①打开【Editor】页面。

　　②在工具栏的【Display】设置中显示互补链。

　　③观察上下两条序列的编号方向。

　　④确认当前选中的是哪一条链。

　　⑤必要时返回【Map】查看箭头方向。

　　下方互补链如果从左往右看，通常对应3′到5′。要把它写成常规5′到3′序列，还要反向读取，不能照着屏幕直接抄。

　　4、检查选区是否多了接头或尾序列

　　引物中带有限制性位点、接头或其他5′尾序列时，只应对模板结合区做反向互补。人工添加的尾序列一般保持原顺序，放在引物5′端。

　　①分开记录模板结合区和附加尾序列。

　　②只转换模板结合区。

　　③把尾序列添加到结果的5′端。

　　④重新检查完整引物方向。

　　要是把尾序列也跟着翻转，限制性位点和接头顺序可能全部变掉。看起来只是几个碱基位置不对，后面的实验设计却会受影响。

　　三、反向互补结果怎么进一步核对

　　方向已经确认后，还要检查这条序列能不能对应到原目标区域。单看字母顺序没问题，不代表选区和注释一定选对了。

　　1、返回目标序列进行匹配

　　①复制生成的反向互补序列。

　　②回到原始DNA文件。

　　③使用序列查找功能搜索双链。

　　④确认匹配位置和长度。

　　⑤查看匹配方向是否符合预期。

　　MacVector在双链搜索中会自动考虑反向互补匹配，因此不需要分别建立“Reverse”和“Complement”两套搜索条件。

　　2、结合Map方向检查

　　反向引物应与正向引物相向排列；负链CDS则应与其转录方向一致。

　　如果两条PCR引物箭头背向排列，或者负链CDS翻转后仍没有合理开放阅读框，就要回头检查选区边界和操作次数。别急着改碱基，方向错误往往才是根源。

　　总结

　　MacVector生成反向互补序列并不复杂，难点主要在链来源和5′、3′方向。处理MacVector反向互补序列怎么生成MacVector反向互补后方向判断错误怎么办时，先确认复制的是模板正链、互补链还是已经生成的反向引物，再决定是否需要翻转。短序列手动核对一次，通常就能避开重复转换和方向抄反的问题。希望本文能为大家处理MacVector序列方向提供参考，如需进一步了解相关内容，可联系咨询。