做PCR引物设计时，很多人会先盯着引物长度和GC含量看，但真正影响后续实验的，往往是几个参数一起作用的结果。MacVector引物设计怎么设置 MacVector引物Tm值异常怎么调整，这个问题不能只看软件界面怎么点，还要把扩增区域、引物长度、Tm范围、GC比例、二聚体和发卡结构一起核对。

　　一、MacVector引物设计怎么设置

　　在操作MacVector软件进行引物设计之前，研究人员需要把DNA模板序列和目标片段明确好，如果直接让软件自动寻找引物，虽然会出来很多结果，但是不一定符合实验目的，尤其是在进行克隆、测序、突变或者常规PCR时，参数的侧重点是完全不同的。

　　1、确认模板序列和扩增区域

　　实验人员打开目标DNA序列之后，要在序列视图或者Map视图里面，把需要扩增的片段位置看清楚，如果只是想扩增某段基因，可以先把这个区域选出来，然后再去点引物设计的功能，这样软件在搜索的时候，就会围着目标区域去选，引物就不会跑到不需要的地方去了。

　　2、进入引物设计功能

　　用户需要依次点击菜单栏的【Analyze】再找到【Primer Design/Test(Pairs)】，这样就能进到成对引物的设计和测试界面了，这个地方可以用来设计PCR用的正向和反向引物，也能把手头现有的引物序列输进去，让MacVector帮忙看看合不合适，软件会自动给出引物解链温度和推荐的退火温度，方便后面去摸索PCR的条件。

　　3、设置产物长度和引物范围

　　如果只是做普通的PCR扩增，实验人员可以先把产物的长度范围定下来，比如设置在几百到几千个碱基对以内，但如果是为了做测序引物，重点就不是产物的长度了，而是引物落在哪、朝着哪个方向读取，参数在设置的时候不能太死板，要是把产物长度、引物长短和解链温度都卡得特别窄，软件就可能找不到结果，或者只能给出一个勉强踩线的方案。

　　4、设置解链温度、碱基比例和引物长度

　　常规的PCR引物，长度一般要控制在18到25个碱基左右，解链温度也要差不多，鸟嘌呤和胞嘧啶的比例要保持在中间水平，正反向引物的解链温度不能差太多，要不然退火温度就没办法照顾到两根引物了，如果是要求更高的定量PCR实验，解链温度就要挨得更紧，通常会参考58到60度左右的范围，不过实际操作中，还是要根据扩增酶和模板的实际情况去改。

　　二、MacVector引物Tm值异常怎么调整

　　解链温度异常一般有几种情况，要么是明显太高了，要么是明显太低了，还有就是正反引物之间差得太远，软件上显示的解链温度只是一个计算出来的数字，并不等于实际实验时一定会成功的退火温度，软件相关的说明也写了，引物解链温度是按照热力学模型去算的，真正好不好的反应条件，还是要靠实验在管子里验证才知道。

　　1、解链温度偏低时先看引物长度

　　如果有一条引物的解链温度明显偏低了，常见的原因就是引物留得太短，或者是腺嘌呤和胸腺嘧啶的比例太高了，实验人员可以把引物结合的位置往前或者往后挪动几个碱基，试着多加1到3个碱基进去，尤其是多加点鸟嘌呤和胞嘧啶，但是不能为了强行拉高温度就瞎加不相关的碱基，只有真正和模板配对的部分才是管用的。

　　2、解链温度偏高时检查碱基比例

　　解链温度要是太高了，通常是因为引物弄得太长了，或者鸟嘌呤和胞嘧啶的比例高了，有时候也是局部连续堆积造成的，这时候可以把引物稍微改短一点，或者把引物的位置往腺嘌呤和胸腺嘧啶多一点的区域移动，要是引物尾巴上的结合力太强，虽然抓得牢，但也容易跑出很多乱七八糟的杂带，这都需要一起检查。

　　3、正反向引物解链温度差距过大时要成对调整

　　很多时候问题不是单条引物不好，而是两条引物不配对，正向引物解链温度是62度，反向的却只有52度，遇到这种差别，退火温度就很不好设，调整的时候不能只改低的那一条，实验人员应该把两条引物的位置都稍微挪一挪，让它们的解链温度慢慢靠拢，通常两条引物的解链温度越接近，后面的PCR条件就越好摸索。

　　4、检查盐浓度和计算条件差异

　　同一条引物在不同的软件里面算出来的解链温度不一样，这倒不一定是MacVector算错了，因为解链温度的计算会受到液体里的盐浓度、引物浓度还有算法模型的影响，软件虽然能显示解链温度和推荐退火温度，但是拿去跟网上的其他工具对比时，得看看两边的计算条件是不是设成一样的了，否则差个几度是很正常的。

　　三、设计完成后还要做哪些检查

　　引物的解链温度调整到合适范围之后，不代表这个设计就完事了，MacVector的好处是能把引物设计、测试、标注和序列管理放在一个软件里弄，省得来回复制序列弄错了，设计完了之后，建议实验人员还是要多做几项核对。

　　1、检查自身折叠和双链互补

　　引物要是自己容易折叠起来，或者正反向引物之间有明显的互补，那就会影响到扩增的效率，软件里的相关工具能帮着检查这些结构问题，特别是引物尾巴上的互补要重点看，因为这里要是粘在一起了，就特别容易自己变成副产物扩增出来。

　　2、核对扩增产物位置

　　选好候选引物之后，实验人员得回到模板序列上去看一眼，确认扩增出来的片段是不是真的把目标区域包进去了，如果目标是一个具体的编码区、突变位点或者测序区域，引物的位置就不能光看产物有多长，得看它是不是真的覆盖到了那个目标位点。

　　3、把引物信息标记回序列文件

　　MacVector支持把设计好的引物和扩增产物直接标记到序列模板文件里面，标记的信息里可以带着引物的特征和序列内容，这样以后复查、把文件传给别人或者重新设计的时候，就不用再到实验记录本里到处翻找了。

　　总结

　　整体来看，用MacVector做引物设计并不是点开功能等软件出答案就行了，比较稳妥的做法是先搞清楚模板和扩增的目标，再通过【Primer Design/Test(Pairs)】把产物范围、引物长短、解链温度和碱基条件设好，最后结合自身折叠、双链互补和扩增位置做筛选，碰到解链温度异常的时候，也不用急着觉得是软件算错了，应该先从引物长短、碱基比例、正反引物配不配还有计算条件去排查，这样弄下来，引物设计和温度调整就会变成一个比较清楚的步骤，而不是光靠软件自动推荐了。