质粒图如果还是一条线性的序列，后面想去查找酶切位点、辨认插入片段和各个功能元件，操作起来就会觉得特别别扭。在MacVector里面，要把质粒变成环状，再把方向调整到合适的状态，这里面的关键是先确认序列的首尾两端能不能顺利地闭合成环，然后再去分析方向上的不协调，究竟是起点位置选得不对，还是插入片段本身的方向接反了。根据官方教程的说明，在克隆工具板（Cloning Clipboard）当中，既可以使用【Circularize】功能来环化，也可以把片段的一端直接拖到另一端，在弹出的窗口里点击【Ligate】，生成一条崭新的环状序列。
一、怎样在MacVector里完成质粒环化
在动手做环化之前，需要先弄清楚序列的来源。如果拿到手的已经是一条完整的质粒，只不过状态显示成了线性，那么可以直接调整它的拓扑结构，或者用克隆工具把它闭起来；但要是手里的序列是由多个测序片段拼接起来的，那就得先把两端的重叠区域、酶切末端或者预先设计的连接位点，全都核对一遍，确认没有问题再往下走。
1.打开准备使用的目标序列。通过【File】→【Open】这一条路径，把FASTA文件、GenBank格式的数据或者MacVector自己的文件导入进来；文件打开之后，先别忙着操作，快速浏览一下序列的总长度、上面标记的注释、重要的酶切位点，尤其要留神头尾两端的碱基顺序，大致判断一下它是一份完整的东西，还是一个缺了关键部分的半成品。
2.检查首尾两端是否具备连接条件。如果序列是从测序拼接得到的，那就得重点看它的头部和尾部有没有重复或者重叠的片段。MacVector在组装拼接片段时，可以在序列拼接编辑器里面，通过右键菜单去检查能不能环化；如果首尾恰好存在一段至少20个碱基的完美重叠，菜单就会给出提示，帮助生成一个新的环状一致性序列。
3.利用Cloning Clipboard执行环化操作。当片段已经被放到了Cloning Clipboard里面之后，直接点击【Circularize】按钮就能完成；或者，用鼠标按住片段的一头，把它拖向另一头，在弹出来的连接设定窗口里再单击【Ligate】。这一步做完以后，MacVector会打开一个新的窗口来展示环状的DNA序列，这个时候最好立刻把这份新文件另存出来，免得回头覆盖了最初的线性序列，以后想找回原始状态就麻烦了。
4.切换到Map视图去核对一下结果。将显示方式改成【Map】，看看质粒是不是已经用圆形的样式呈现在画布上了，那些功能元件、启动子、抗性基因、复制起点，还有多克隆位点，是否都还待在合理的位置；如果有些注释刚好跨过了环形的起点，也要留心去核实一下，显示的这些信息是不是仍然保持完整。
二、环化之后方向不合适要怎么调整
质粒环化成功了，但如果觉得显示出来的方向看着别扭，先别急着把整条序列都做一次反向互补。很多情况下，问题只是出在环形起始点没有放在习惯看到的位置上，比如0点没有恰好落在复制起点的前面、启动子旁边，或者多克隆位点附近。
1.首先尝试调整圆形的起点。在版本比较新的MacVector里，可以把光标放到打算作为新起点的两个碱基中间，右键选择【Set Circular Origin】；按照官方提供的小技巧，从13.5版开始，就可以用这个方法来改变一条环形序列的起点了，整个操作非常直接。
2.借助酶切位点来重新定位起点。如果手上的版本还比较旧，也可以先在【Map】视图里面选好一个限制性内切酶的位点，执行一次【Digest】，然后回到Cloning Clipboard里，依次点击【Circularize】和【Ligate】，就能生成一个以这个酶切点作为新起点的环状质粒，相当于用间接的方式完成了起点的调整。
3.判断要不要做反向互补。假如仅仅是希望质粒图从另一个地方开始展示，用【Set Circular Origin】就足够解决问题了；但如果发现启动子、开放阅读框的箭头，或者插入进去的片段，它们整体的朝向和最初的设计正好相反，这时候才需要去考虑反向互补，或者把片段重新连接一遍。一定要把“调整起点”和“翻转方向”这两件事分开来看。
4.专门复查插入片段的朝向。在MacVector的克隆教程里曾经演示过，同样的一段插入片段，通过不同的端点去连接，可以分别产生正向和反向两种环状的构建体，而且还能用模拟的酶切图谱把它们区分开。如果发现插入片段的方向确实不对，正确的做法是回到Cloning Clipboard里面，重新选择连接时用的端点，而不是只在最终的图上硬把方向改过来。
三、环化完成后需要怎么复核
质粒环化完，需要重点复核的有三处：总长度是否正确、连接位点是否精确、各个功能元件的箭头指向是否合理。光是屏幕上看到一个漂亮的圆环还远远不够，连接点哪怕只差了一个碱基，跟在它后面的引物设计和表达验证，很可能就跟着出问题。
1.核对最终生成的质粒长度。环化完以后的全长，应该和预先估算好的长度保持一致；要是首尾两段本该去掉的重叠区没有被正确删除掉，那么结果就会偏长，反过来，如果在连接过程中不小心弄丢了末端的一些序列，长度就会变短，这种误差很容易发现。
2.把连接处的位点放大后仔细检查。凑近去看酶切留下的末端、重叠区域的序列、连接的痕迹，还有阅读框的状况，一样都不要漏掉；如果质粒当中还牵扯到了开放阅读框的融合，那就得额外核对起始密码子、终止密码子，以及整个阅读框是不是从头到尾都保持连续，没有在什么地方被意外打断。
3.在Map视图里核对功能元件的箭头指向。依次去检查启动子的方向、蛋白质编码序列（CDS）的方向、标签的方向、抗性基因的方向，以及复制起点的方向。一旦发现有对不上号的地方，先分清是注释的方向标错了，还是插入片段的方向弄反了，又或者是整整一条序列都有必要做一次反向互补，然后再分别处理。
4.把两个版本同时保存下来。比较稳妥的方式，是把原始的线性序列和环化好的质粒序列，各自都保留一份。往后如果发现起点或者方向还是不够理想，就可以重新打开最初的那份线性文件再处理一遍，而不是在一个文件上反复修改，改到最后连自己都分不清哪一步做了什么变动。
总结
在MacVector里面做质粒环化，以及环化完以后调整方向，核心的步骤就是先把线性的序列可靠地闭合成圆形的质粒，然后才去区分圆形的起点调整和片段方向的调整。环化操作可以通过Cloning Clipboard里的【Circularize】和【Ligate】来完成，起点的调整则可以用【Set Circular Origin】命令去处理；要是插入片段的方向接反了，那就得回到Cloning Clipboard里重新选择连接的端点，或者生成一个反向的构建体。在这些步骤都做完之后，再去核对长度、连接位点、阅读框和各个功能元件的箭头方向，这样出来的质粒文件，才算真正达到了可以继续往下做设计、做记录的可用状态。
