PCR引物看着只是两段短短的序列，可真到了做实验的时候，很多人会卡在退火温度这一关上。MacVector里引物退火分析怎么做，不同引物的退火温度又该怎么放在一起比较，这里头的关键，是不能光盯着一条引物的Tm值去看，而是得把这一对引物，搁到目标序列里头，去做一次完整的检查。MacVector的【Analyze】菜单下，有一个【Primer Design/Test(Pairs)】功能，它既能靠Primer3那套算法去自动找引物，也能让你把已经设计好的引物对输进去做测试，跑完之后，会把每一条引物的Tm值，还有推荐用的那个退火温度Ta，都一块儿给列出来。

　　一、引物退火分析怎么做

　　在MacVector上做引物退火分析之前，我们得先确认好，目标DNA序列的方向是对的，而且待扩增的那块区域，也已经被稳稳当当地选好了。引物分析这事儿，可不单单是算出一个温度数字来那么简单，它还得去看引物待在什么位置上、最后能扩出多大的产物、GC含量是多少，以及有没有潜藏着错配的风险。

　　1、先把目标序列打开

　　在MacVector里头，去把DNA的序列文件给打开，然后去瞧一眼它的长度、方向，还有上头标好的注释信息。要是你手里的是一个质粒序列，就得先闹明白它是个环状的，还是个线性的；如果只是一段基因片段，那就要去核实一下，它的起头和结尾，有没有在复制的时候给弄错了。

　　2、进到引物对的分析功能里去

　　去点一下【Analyze】菜单，然后找到【Primer Design/Test(Pairs)】这个选项。要是你想让软件帮着自己去找引物，那就可以叫Primer3去搜一遍目标区域；要是你手里已经捏着正向和反向引物了，那就直接把这两段序列，给输进那个测试的窗口里去。按照MacVector的说明，这个功能，它既能帮着去寻摸合适的引物，也能拿来测一测，你已经有了的引物对，到底适不适合拿来做PCR。

　　3、去查看Tm和Ta的结果

　　等分析跑完了，就要把眼睛盯在Forward Primer Tm、Reverse Primer Tm、Product Tm，还有它给推荐的那个Ta，这几样数据上。MacVector的相关文章里讲到过，跑出来的结果，会同时把每条引物自己的Tm值，还有最合适的那个退火温度Ta，都给报告出来。你可千万别，光是把这两条引物的Tm拿过来，简简单单地求个平均数，就当成实验时要用的退火温度了。

　　4、再查查特异性和产物的情况

　　接着还要去瞅一眼，扩增出来的产物有多长、引物结合在什么位置上，还有，有没有特别明显的、不该结合也结合上去的非特异性信号。Tm值合适，可不代表这条引物就一定是好的，要是它结合的位置给弄错了、扩出来的产物太长了、3端藏着错配，又或者是形成了很显眼的二聚体，那实验照样很容易就栽跟头了。

　　二、引物退火温度怎么放在一起比较

　　在拿不同的引物，去比较它们的退火温度时，得先把它们搁在同一套计算条件下头去看。不一样的软件、盐浓度、引物浓度，还有聚合酶的算法，这些东西只要一变，跑出来的Tm数值自然就会有差异，这倒是挺正常的一件事。

　　1、先去比一比两条引物Tm的差距

　　正向和反向这两条引物，它们的Tm值，最好是离得近一些。要是这差距拉得太大，那在定退火温度的时候，就很难把这两条引物都给伺候舒服了，温度低了，非特异性就容易冒出来，温度高了，又可能有一条引物死活都结合不上去。

　　2、要优先去参考那个推荐Ta

　　MacVector在引物对的分析里头，是会直接给出来一个推荐的Ta值的，而不是就甩给你一条引物的Tm便不管了。MacVector的资料还讲到，它不光会去算左右引物的Tm和产物的Tm，还会在结果那一列里，给出推荐用的退火温度。所以当我们在比较多组引物的时候，是能把那个Ta值、Tm的差距，还有产物的长度，这几样东西绑在一块儿去综合看的。

　　3、同一批引物，得拿同一套算法来比

　　你可别把A引物扔给MacVector去算，转身又把B引物塞给另一个网页工具去跑，然后把得出来的数，就这么直愣愣地放在一块儿比高低。Thermo Fisher的Tm工具也提到过，Tm值和退火温度这些东西，是会受到引物浓度、用的是哪一种聚合酶，还有计算方法的影响的。真要去做横向比较的时候，最好是让它们都在同一个工具底下，用同一套参数来跑。

　　4、做实验的时候，要给梯度留出空间来

　　要是两组引物的Ta值，看着是差不多，那在动手做实验的时候，就可以先照着推荐的那个Ta，在它的上下，去设上一个梯度的范围，比方说，往上往下，都浮动个2到5摄氏度。IDT那边也提到过，退火温度这事儿，通常跟引物的长度和组成是直接挂上钩的，一个常见的经验是，把它设在比引物Tm要低上差不多5摄氏度的位置上，可说到底，这具体该定在哪个点，还是得结合你自己的目标和实际的反应体系，去做出判断。

　　三、退火分析的结果对不上，要怎么处理

　　一旦MacVector跑出来的结果，跟以前的实验记录，或者是别的工具算出来的东西，对不到一块儿去的时候，可先别急着就说软件给算错了。我们要做的，是先把输进去的序列、用到的参数，还有实验的体系，都给从头到尾、好好地核对上一遍。

　　1、检查引物序列本身

　　要把它给弄准了，看看序列里头，是不是多敲了一个空格、是不是少填了一个碱基，还有那条反向引物，可别一个不留神，就给填成了反向互补序列。这序列的填法要是错了，那后面算出来的Tm值，还有产物的位置，就全都跟着一块儿跑偏了。

　　2、再查一查目标区域

　　要是你用的那个模板序列，它的版本跟人家的不一样，又或者是你的引物，它正好跨过了突变的位点、插入片段的边界，那它结合上去的样子，自然也就跟着不同了。这个时候，你是可以跑到Map视图里头，去把它给坐实了，看看那引物，到底是一头扎在了哪个具体的落点上。

　　3、要结合聚合酶的说明书去调整

　　不同厂家的聚合酶，它们自己推荐的退火温度，并不是一刀切、全一个样的。在正式开始做实验以前，比较把稳的法子，是把MacVector给出来的那个Ta值，当成一个起跑点，然后再去把酶的说明书给翻出来，同时结合着梯度PCR跑出来的结果，给它做上一点点微调。

　　总结

　　在MacVector里头做引物退火分析，一个比较推荐的路数是，去用【Analyze】菜单底下的【Primer Design/Test(Pairs)】功能，把你那一对引物，搁到目标序列里头，去跑上一遍测试。等到要比较退火温度的时候，可别就只盯着一条引物的Tm值死看，得把两条引物Tm之间的那个差距、产物的Tm、软件推荐的那个Ta值、产物有多长，还有特异性好不好，这几样东西，全都给放到一块儿去瞅。万一跑出来的结果对不上了，这头一个要奔去查的，就是引物序列有没有给填错、模板的版本是不是有出入、还有计算时候用的条件一不一样，末了呢，再拿梯度PCR去给它做上一回最后的拍板。