在进行基因片段的检查、克隆序列的确认，实验人员对于开放阅读框的观察，不能局限于是否存在一段从ATG开始到终止密码子结束的长片段，而是更需要去关注该片段具体位于哪条链上，其属于哪一个读码框，以及该片段是否能够与已有的CDS注释相互对应。关于MacVector开放阅读框怎么查找，以及MacVector开放阅读框方向怎么判断的问题，一种在实际操作中比较可行的方法是，实验人员先利用Map视图进行一次快速的浏览，随后利用【Analyze】菜单中的ORF分析功能展开进一步的确认，而对于方向的判断，则需要将箭头指示、正负链的翻译情况以及CDS注释结合在一起进行观察。

　　一、MacVector开放阅读框怎么查找

　　MacVector这款软件能够对被打开的DNA序列进行自动的扫描，以此来寻找开放阅读框，并将寻找的结果呈现在Map标签页里面；在序列本身没有现成ORF注释的情况下，实验人员也可以点击【Analyze】→【Open Reading Frames】这一路径，来对候选区域进行查找。

　　1、打开DNA序列并查看Map标签页

　　当实验人员把FASTA格式、GenBank格式或者MacVector格式的核酸文件打开之后，应当首先把界面切换到【Map】视图。

如果被打开的序列是一个空白的片段，MacVector通常会在Map界面中把自动扫描得到的ORF显示出来；如果该序列是已经包含注释的序列，那么研究者还需要注意已有的CDS、缺失的功能特征以及限制性位点是否在同时显示，以此来防止自动提示的内容与正式的注释内容发生混淆。

　　2、检查自动扫描是否开启

　　实验人员需要进入到【MacVector】→【Preferences】→【Scan DNA】或者相关的DNA Map设置区域当中，去确认开放阅读框的显示功能没有被关闭。

在这一位置上，研究者也可以对最小密码子数、线性序列末端的处理办法，以及是否要对已经注释为CDS的ORF进行抑制等参数进行调整。由于MacVector的ORF自动显示设置会对其后新打开的序列产生影响，因此，如果发现在别人的电脑上可以看见、但在自己的电脑上看不见时，应当优先对这里的设置进行检查。

　　3、手动运行ORF分析

　　自动显示的功能仅仅只能协助研究者进行快速的浏览，在进行正式的检查时，建议实验人员还是应当重新运行【Analyze】→【Open Reading Frames】。

在进入到分析窗口里面以后，需要将重点放在最小长度、起始密码子、终止密码子以及末端处理这些选项上。如果面对的是完整的基因片段，实验人员可以把筛选的条件设置得更严格一些；如果面对的仅仅是测序拼接出来的片段或者是基因中间的一段，条件设置得太严格，就容易把候选的ORF漏掉。

　　二、MacVector开放阅读框方向怎么判断

　　在对ORF的方向进行判断的时候，研究者不可以仅仅根据“在图表上看起来是在上面还是在下面”来得出结论。对于环状的质粒、反向插入的片段，或者是Sanger测序拼接得到的结果来说，方向发生弄反的情况是非常普遍的。在判断的过程中，需要把Map里的箭头、正负链的翻译、起止密码子，以及已知的功能区域全部放在一起进行对照，如此才能够减少误判的发生。

　　1、先看Map里的箭头方向

　　在Map视图的界面当中，ORF一般会用箭头的样式被表现出来。箭头会顺着序列编号逐渐增加的方向进行延伸，这通常可以被理解成是位于正向链上的候选ORF；当箭头呈现反向，或者是显示在互补链的方向上的时候，实验人员则需要考虑该ORF是不是处在minus strand上面。

　　2、打开正负链翻译辅助判断

　　在序列编辑的视图里面，实验人员可以通过点击Display或者Strands相关的按钮，来把翻译的结果显示出来。

Show Plus Strand Translations这一功能会把+1、+2、+3这三个正链的读码框呈现出来，而Show Minus Strand Translations则会把-1、-2、-3这三个负链的读码框呈现出来。

　　3、对照起始密码子和终止密码子

　　某一个方向上看起来存在比较长的ORF，这并不能代表该方向就是实际的编码方向。

实验人员应该去检查一下，在这个方向上是不是真的存在合理的起始密码子和终止密码子，并且还要确认中间没有发生提前终止的情况。。

　　三、找到ORF后还要怎样复核

　　在ORF被查找出来之后，通常不建议立即把它作为基因的最终结论。开放阅读框仅仅属于候选的编码区域，在后续的过程中，还需要对片段的完整性、物种的密码子偏好性、同源性搜索的结果以及实验的目的进行综合考量。特别是在面对未知片段的时候，长的ORF可能仅仅只是一条线索，并不等同于其功能已经得到了确切的证实。

　　1、把候选ORF转成CDS注释

　　实验人员在结果窗口当中把需要的ORF选中之后，可以把它拖拽回到原始的序列窗口里面，此时MacVector会把这个ORF转变为永久性的CDS Feature，并且会自动把预测的氨基酸翻译信息填入进去。这个操作非常适合用于克隆片段的整理或者是测序结果的确认，但是研究者在此之后还应该把gene、product等注释内容补充完整，以此来避免后续的文件里只剩下一串含义不明的CDS。

　　2、用翻译序列做同源性检查

　　如果实验的目的是为了判断未知的片段是不是某一个蛋白质的编码区，研究者可以在选中ORF之后去运行翻译功能，然后再把得到的蛋白质序列拿去进行BLAST或者数据库的比对。仅仅在DNA层面去观察ORF的长度是不够充分的，在蛋白质层面上所体现出来的保守结构域、关键的位点以及同源蛋白质的长度，往往能够说明更多的问题。在遇到反向的ORF的时候，也可以先对minus strand进行确认，然后再去决定是不是需要对整个序列进行反向互补处理。

　　3、调整最小长度过滤杂乱结果

　　在短序列、AT含量不正常的区域，或者是质粒的多克隆位点附近，往往会形成很多小的ORF。在这种情况下，实验人员可以适当地把Minimum Number of Codons的数值调高，从而让得到的结果显得少一些；如果研究者分析的对象是短肽、病毒的小基因或者是截短的测序片段，那么就不应该把这个阈值设置得太高。参数的设置并不是越严格就越好，而是需要与样本的类型相配合。

总结

　　综合上文来看，关于MacVector开放阅读框的查找，实验人员可以先从【Map】的自动显示开始入手，随后利用【Analyze】→【Open Reading Frames】来进行一次明确的分析；对于方向的判断，则需要同时对箭头、+1/+2/+3与-1/-2/-3的翻译、起止密码子以及CDS注释进行观察。把这些细节问题结合起来，关于MacVector开放阅读框怎么查找以及MacVector开放阅读框方向怎么判断的问题，就能够实现从“软件呈现了什么”到“该编码区究竟能不能投入使用”这一过程的推进。