同一份质粒序列，别人提供的图谱有某个酶切位点，MacVector里却找不到；或者位点数量相同，预测片段长度仍对不上。遇到这种情况，可以先检查序列拓扑和酶筛选条件。图谱显示的是当前序列、酶文件及筛选设置共同得到的结果，并不一定完整展示所有识别位点。

　　一、MacVector如何分析限制性酶切位点

　　分析前应确认使用的是完整质粒、插入片段还是PCR产物。序列范围不同，即使文件名称相近，切点和片段预测也会不同。

　　1、确认序列及拓扑

　　①打开目标DNA文件，在【Editor】中核对序列长度、首尾内容及插入片段，保存一份用于本轮分析的副本。

　　②查看序列窗口工具栏的【Topology】，按实际分子选择线性或环状。

　　③切换到【Map】，观察图谱，并确认分析对象没有误用成载体骨架或局部片段。

　　质粒通常按环状分子分析，PCR产物通常按线性分子分析。仅改变图谱的显示样式，不能代替对序列真实拓扑的设置；跨越环状序列起点的识别位点尤其容易受影响。

　　2、运行限制性酶切分析

　　①激活目标序列窗口，选择【Analyze】→【Restriction Enzyme】。

　　②点击【Choose】核对所用酶文件，在【Search Using】中选择全部酶或已选酶。

　　③初次排查时，适当放宽识别序列长度、末端类型和切点数量等限制，再点击【OK】运行分析。

　　④在结果筛选窗口检查保留条件，确认没有按切点数量、区域或末端类型排除目标酶。

　　⑤查看结果图谱和位点列表，记录酶名称、切点位置及切点数量。

　　【All Enzymes】指所选酶文件中的全部酶，并不代表数据库中所有已知酶。目标酶不在当前文件中时，应先更换或检查酶文件。

　　二、MacVector酶切图谱与预期不符如何核查

　　可以先挑一把存在争议的酶单独检查。确认它是否被搜索、是否被隐藏，再核对识别序列，比同时比较几十个标签更容易定位问题。

　　1、检查酶是否被筛掉

　　①在【Map】中打开【RE Picker】，核对目标酶是否位于当前列表中并已勾选。

　　②检查【Cuts】范围。如果只保留单切酶，多切酶就不会按原预期显示。

　　③通过【Prefs】进入【Scan DNA】→【Restriction Sites】，检查酶文件、已选酶范围及【Maximum number of cut sites】。

　　④对较长序列，检查自动扫描的长度限制，再用【Analyze】→【Restriction Enzyme】单独验证目标酶。

　　【Map】中的自动显示与手动分析可以采用不同设置。一处显示、另一处不显示时，应先对齐酶文件和筛选条件，不能直接判断序列中没有该位点。

　　2、核对是否为同一版本序列

　　①回到【Editor】，检查插入片段两端、连接区域和预期位点附近的碱基。

　　②对照测序结果及构建记录，确认是否发生突变、片段替换、缺失，或引物尾部引入了新位点。

　　③若与参考图谱比较，先确认总长度及序列内容一致，再比较坐标。

　　环状序列可以从不同位置开始编号。同一位点的数字位置不同，未必代表结构不同；若参考序列起点或方向改变，应结合位点周围序列及片段长度判断。

　　3、区分识别位置、切割位置和候选位点

　　①在【Map】中将鼠标停在目标位点上，查看提示中的识别序列、切割位置及切点数量。

　　②在【Graphics Palette】中点击【Zoom to Residue】，放大到碱基层级，核对双链切割及突出端。

　　③检查带星号的“one-out”位点，确认它是否需要改变一个碱基后才能形成。

　　识别序列所在位置与实际切割位置并非总是相同，部分酶会在识别序列外切割。“one-out”则属于潜在可引入位点，不能作为原序列已经存在的切点计算片段。

　　4、将图谱预测与实验异常分开检查

　　①确认软件中的序列与实际样品相符，再核对酶的甲基化敏感性及DNA来源。

　　②对照厂家资料检查反应条件，排查不完全酶切、星号活性及样品污染等因素。

　　③保留未切样品和酶切样品的电泳记录，结合预测片段判断异常条带，不要为了匹配胶图而修改序列。

　　存在识别序列，不代表实际样品在所有条件下都能被切开。甲基化可能阻碍切割，不完全酶切也可能留下较大片段，这些情况不能单靠位点图谱确认。

　　三、怎样用片段长度复核酶切结果

　　位点标签核对后，还可以用片段长度做一次独立检查。尤其是双酶切，不能只看两把酶是否都出现，还要计算它们之间形成了哪些片段。

　　1、手算一组预测片段

　　①在【Map】及分析结果中记录总长度和所有实际切割位置，确认【Topology】设置正确。

　　②在线性序列中，将首端到首个切点、相邻切点之间及末个切点到末端的长度分别列出。

　　③对环状序列，另计最后一个切点跨越序列起点到第一个切点的片段，检查各片段之和是否等于总长度。

　　例如，6000 bp环状DNA在1000和3000位置各切一刀，得到2000 bp与4000 bp两个片段；相同坐标在线性DNA中则形成1000、2000和3000 bp三个片段。

　　2、用模拟凝胶辅助比较

　　①选择【File】→【New】→【Agarose Gel】，建立模拟凝胶。

　　②从序列【Map】或限制性酶切分析结果中，将所需酶拖入凝胶，建立相应酶切泳道。

　　③查看条带对应的片段长度，再与手算结果和实际电泳记录比较。

　　长度接近的片段可能难以在胶上分开，因此可见条带数不一定等于片段数。判断时应保留长度列表，避免只凭图谱外观或条带数量下结论。

　　总结

　　保存构建资料时，一张酶切图谱若同时注明序列来源、长度和所用酶文件，后续接手人员就更容易复现分析。样品编号相近、构建经历过多次修改时，这些信息尤其有用，也能帮助区分是设计发生变化，还是实验条件需要继续排查。图谱与测序、构建记录相互对应，才方便安排下一步验证。希望这些操作能帮助大家更顺利地使用MacVector开展酶切分析。如果有序列分析、图谱核查等方面的需求，欢迎联系咨询。